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Konzept für ein Humanzytomprojekt


G.Valet 1) , A.Tárnok 2)
1) Arb.Gruppe Zellbiochemie, Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried
2) Pädiatrische Kardiologie, Herzzentrum Leipzig GmbH, Universitätskliniken Leipzig


Einleitung

Die Sequenzierung der Humangenoms hat zu einem deutlichen Wissenszuwachs bezüglich der biomolekularen Kapazität von Organismen geführt. Trotzdem kann bisher nur ein sehr begrenzter Teil der strukturell und funktionell vielschichtigen Biokomplexität von Zellen und Zellsystemen (Zytome) durch dieses Wissen erklärt werden.

Die Vorhersage dreidimensionaler (3D) Proteinstrukturen aus ihren Aminosäuresequenzen ist ein typisches Beispiel für das bereits auf biomolekularer Ebene auftretende Komplexitätsproblem, welches noch weit von der strukturellen und funktionellen Komplexität von Zellen und Zellsystemen entfernt ist. Genaue Vorhersagen der Proteinstruktur aus Aminosäuresequenzen sind auch nach über 30 Jahren intensiver Forschung und trotz der explosiven Entwicklung von Hard- und Softwarekapazität in der Zwischenzeit. immer noch schwierig.

In der pharmazeutischen Industrie hat der Übergang von der früheren Physiologie zur nunmehr Zielmolekül orientierten Suchstrategie trotz substantiell erhöhter Investitionen in den vergangenen 10 Jahren zu deutlich weniger neuen Zielmolekülen als in der vorangegangenen 10 Jahresperiode geführt. Dies deutet darauf hin, daß mehr Wissen über Krankheits-relevante molekulare Mechanismen und Stoffwechselwege erforderlich ist.


Problemstellung

Betrachtet man die weit schwierigeren Vorhersagen über Assoziation und Funktionalität von Biomolekülen in lebenden Zellen als Produkte der 20-30.000 kodierenden Gensequenzen, so erscheint es gegenwärtig außerhalb der Reichweite, die enorme Biokomplexität von Zellen oder Zellsystemen (Zytome) in kürzeren Zeiträumen allein deduktiv vom Gen zur Realisierung d.h. von unten nach oben (bottom-up) gerichtete Hypothesenbildung mit anschließender experimenteller Verifizierung zu verstehen. Die hohe Redundanz molekularer Reaktionswege wie z.B. beim cell signalling, bei der Zellproliferation oder während der Apoptose erfordert eine Vielzahl von Hypothesen induzierten Untersuchungen zur Sammlung einer großen Menge von Details, ohne Sicherheit sich auf letztlich relevante Krankheits-assoziierte Stoffwechselwege, molekulare Brennpunkte oder pharmazeutische Zielmoleküle fokussiert zu haben.

Multiparametrische Einzelzellanalysen mittels Zytomik ermöglichen einen direkten Zugang zu dieser Komplexität insbesondere bei Krankheitsprozessen. Da Krankheiten durch molekulare Änderungen in Zellen entstehen und Zellen gleichzeitig die elementaren Funktionseinheiten von Zellsystemen und Organen darstellen, können differentielle Änderungen der molekularen Einzelzellphänotypen mittels Datenmusteranalyse zwischen beispielsweise kranken und gesunden Personen festgestellt werden. Molekulare Zellphänotypen resultieren aus Genotyp- und Expositionseinflüssen.

Hypothesen-gesteuerte Parameterauswahl unter Verwenung der Genomsequenz als Inventarliste für die biomolekulare Kapazität von Organismen in Verbindung mit Hypothesen-freier Datenmusteranalyse sind in der Lage, neue Wissensräume zu eröffnen, die der Hypothesenbildung vorher verborgen waren. Als eine der Konsequenzen der Datenmusterklassifizierung wurde das Prädiktivmedizin mittels Zytomik Konzept für die personalisierte Medizin entwickelt. Sein Anwendungspotential ist deutlich größer als bei der personalisierten Medizin mittels Pharmakogenomik oder mittels Genomik, die auf genetischen Varianten beschränkt ist.

Die Erfassung naturinduzierter systematischer Zellphänotypänderungen während Krankheiten in Form prädiktiver differentieller Datenmuster (top-down) identifziert klinisch relevante molekulare Brennpunkte und Krankheitsäquivalente mit einem vergleichsweise geringen Forschungsaufwand. Die Information aus den differentiell ermittelten molekularen Brennpunkten kann in einer zweiten Phase mittels biomedizinischer Zellsystembiologie entziffert werden, um Krankheits-spezifische molekulare Mechanismen zu erfassen und im Hinblick auf die Entdeckung neuer pharamzeutischer Zielmoleküle und Leitstrukturen mathematisch zu modellieren. Diese Vorgehensweise überspringt zunächst die zeitaufwendige Phase der systematischen Störung von Modellzellsystemen, mit der entsprechend dem Systembiologiekonzept (bottom-up) Einsicht in die Reaktivität solcher Systeme als Vorbedingung für das Studium von Krankheitsprozessen genommen werden soll.

Als eine der Konsequenzen aus diesen Überlegungen wurden external link Gedanken über die Herausforderung eines Humanzytomprojektes formuliert. Diese erzeugten Interesse und resultierten in einer Initiative zur formalen Etablierung eines solchen Projektes (L1-L5).


Informationssammlung

Zellsysteme sind aus verschiedenen Arten von Einzelzellen als Elementareinheiten der Organe und Organismen zusammengesetzt. Die Einzelzellanalyse vermeidet das Problem gemittelter Resultate aus Zell- oder Gewebshomogenaten, bei denen gemessene molekulare Veränderungen falsch interpretiert werden können, da sie auf Änderungen in allen Zellen oder lediglich in spezifischen Subpopulationen beruhen können, während der Nachweis von Änderungen in anteilig gering vertretenen Zellpopulationen infolge Verdünnung möglicherweise wegen Absinken unter die Nachweisgrenze unmöglich werden kann. Diese Probleme werden durch die Einzelzellanalyse des molekularen Zellphänotyps als Resultat von Genotyp und Exposition zuverlässig vermieden

Die anhaltende Entwicklung neuer bild- und durchflußzytometrischer Instrumentation, wie konfokale oder Laserscanning Mikroskopie mit Mehrfarbenbandpass- oder spektraler Bildgebung, Multiphotonenfluoreszenzanregung, Fluoreszenzenergietransfer (FRET), schnelle durchflußzytometrische Fluoreszenzbildaufnahme, optische Zelldehnungsmessung im Durchfluß, miniaturisierte Durchflußzytometrie auf Laborchips oder die Lasermikrodissektion von Geweben stellt einen erheblichen Fortschritt für die molekulare Einzelzellanalyse dar. Biomolekulare Analysetechniken, wie Partikelmatrixanalyse (bead arrays), Einzelzell-Polymerasekettenreaktion (PCR), Tyramid-Signalamplifikation, oder Biomolekülmarkierung durch Quantumdots, magnetische Nanopartikel und Aptamere eröffnen neue Horizonte der molekularen Spezifität und Sensitivität.

Die Dimensionalität von Zelldaten kann bei der Erhebung vielschichtiger molekularer Zellprofile erheblich sein z.B. bei der wiederholter Anwendung von Vielfarben-Fluoreszenzfärbeprotokollen in Gegenwart von zahlreichen unterschiedlichen Zellpopulationen. Zunächst können mehrere Zellfunktionen vitaler Zellen, wie z.B. intrazellulärer pH-Wert, Transmembranpotentiale oder Ca2+-Spiegel angefärbt werden, gefolgt von Zellfixation zur Beseitigung der Vitalfärbungen und Anfärbung intrazellulärer Bestandteile, wie Antigene, Lipide oder Kohlenhydratstrukturen. Nach erneuter Entfärbung können spezifische Nukleinsäuren gefärbt werden. Mikroskopische Bildaufnahme- und Analysegeräte mit ihren Relokalisierungsmöglichkeiten werden zunehmend solche Färbesequenzen ermöglichen. Die traditionelle visuelle oder quantitative Erfassung der Inhalte von Auswertefenstern in zwei- oder dreidimensionalen zytometrischen Histogrammen sammeln nur eine sehr begrenzte Menge der verfügbaren Information, und es ist dabei niemals sicher, ob die wirklich wichtige Information überhaupt erfaßt wurde. Zusätzlich zeigt die Erfahrung, daß es nicht einfach ist, qualitätskontrollierte Konsensusstrategien für die Multiparameterdatenanalyse zu entwickeln.

Außerdem gibt es wenig Interpretationswissen über sehr komplexe zytometrische Vielparameterdatenräume. Wesentliche Information kann deshalb einfach durch einen Mangel an Bewußtsein über deren Existenz verlorengehen.


Datenanalysestrategien

Betrachtet man die Anstrengungen für Probensammlung, Färbung, Messung und Datenanalyse, so erscheint es routinemäßig erforderlich, automatische Auswertestrategien mit selbsteinstellenden Auswertefenstern zu verwenden, um möglichst den gesamten Informationsgehalt aller gemessenen Zellen für die nachfolgende Wissensextraktion zu erfassen. Das bedeutet z.B. für die Durchflußzytometrie in der Praxis, daß neben der prozentualen Häufigkeit von Zellen auch die Mediane und Mittelwerte von Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignalen sowie die Lichtstreuungs- und Fluoreszenzsignalverhältnisse, ebenso wie die Variationskoeffizienten aller ausgewerteten Parameter in allen Auswertefenstern ausgerechnet und die jeweiligen Werte in Datenbanken abgelegt werden sollten. Das Bemühen sollte es sein, die Information von mehr als 95% aller gemessenen Zellen zu erfassen, um ausreichend sicher zu sein, daß keine relevante Information verloren geht.

Dabei ist es z.B. empirisch ratsam, für durchflußzytometrisch durch Vorwärts- (FSC) und Seitwärtslichtstreuung (SSC) oder typische Antigenexpression z.B. CD45 eindeutig charakterisierte Zellpopulationen, wie Lympho-, Mono- oder Granulozyten, selbsteinstellende, sich nahtlos berührende Auswertefenster für die automatische Analyse zu benutzen. Die anschließende Bestimmung weiterer Eigenschaften dieser Zellpopulationen bezüglich der Expression Fluoreszenz-gefärbter Eigenschaftsmuster in den jeweils durch Projektion ermittelten Zweiparameterhistogrammen kann durch Quadrantenanalyse mit feststehenden Grenzen ebenfalls automatisiert werden. Hierbei ist es nicht von vorrangiger Bedeutung, daß eventuelle Zellpopulationsgrenzen genau respektiert werden, da relevante Informationen in der nachfolgenden Datensiebung zur Ermittlung der diskriminantesten Datenmuster in jedem Falle erfaßt werden, vorausgesetzt die Information von mehr als 95% aller Zellen wurde während der Phase der Informationssammlung eingebracht.


Bioinformatische Wissensextraktion

Die Wissensextraktion nach der allgemeinen Informationssammlung stellt eine sehr wesentliche Aufgabe dar. Die gesammelte Information kann ohne weiteres mehrere tausend Datenkolonnen umfassen. Die Klassifzierung von solchen Anzahlen von Datenkolonnen mittels statistischer Vorgehensweise, Hauptkomponentenanalyse, Fuzzy-Logik, neuronalen Netzwerken oder selbstorganisierende Matrizen überschreitet häufig die Kapazität typischer Softwarepakete. Die Klassifizierungsresulte dieser Analysestrategien können auch bis zu einem gewissen Grad von Annahmen über die mathematische Verteiltheit von Parameterwerten oder von vordefinierten Schwellwerten der Korrelationskoeffizienten bei Clusteranalysen abhängen. Fehlende experimentelle Werte müssen unter Umständen unter Verwendung von Annahmen ergänzt werden, oder diesbezügliche Datensätze sind nicht verwendbar, was das Klassifizierungsresultat beeinflussen kann.

Die Datensiebung als alternative nicht-statistische Wissensextraktionsstrategie erfordert keine mathematischen Annahmen über Werteverteilungen, fehlende Experimentalwerte müssen nicht ergänzt werden, die Analyse ist für Parallelprozessierung geeignet und inhärent schnell, da nur Schwellwertvergleiche zur Klassifizierung erforderlich sind.


Relationales Zellklassifizierungssystem

Multiparametrische Durchflußzytometer und Mikroskope stellen komplexe Instrumente dar, bei denen auch zwei Instrumente aus derselben Bauserie, obwohl sie aus denselben Bauteilen zusammengesetzt sind, keine identischen Resultate für die Messung gleicher Proben oder Einzelzellen ergeben. Diese Ungleichheit entsteht durch die Toleranzbereiche der vielen elektronischen, optischen und mechanischen Komponenten solcher Meßsysteme. Fluoreszenz- und Lichtstreusignale werden unter Verwendung relativer Skalen gemessen und die Zellpopulations-orientierten Bemessung der Auswertefenster bei der Histogrammanalyse ist zu einem gewissen Grade willkürlich. Diese Richtigkeitsfehler verschwinden zum größten Teil, wenn alle Meßwerte relational als Bruchteil der jeweiligen Mittelwerte von geeigneten Referenzgruppen ausgedrückt werden. Der relationale Bezug erhält die relativen individuellen Postionen der Parametermittelwerte und auch ihrer Variationskoeffizienten als Dispersionsmaß der Werteverteilungen.

Wenn Referenzgruppen desselben Typs in verschiedenen Laboratorien vermessen werden, sind sie bei Klassifizierung gegeneinander nicht voneinander unterscheidbar, vorausgesetzt sie sind aus repräsentativen Referenzpersonen oder Proben zusammengesetzt und mit Langzeitpräzision und spezifischen Reagenzien vermessen worden. Referenzgruppen können durch Konsensus definiert werden. Auf diese Weise ist eine standardisierte und laborunabhängige Klassifizierung relationaler Daten möglich und relationale Datenbanken aus verschiedenen Labors können in größeren Datenbanken zusammengeführt werden. Ergeben sich bei der Klassifizierzung Unterschiede zwischen korrekt zusammengesetzten Referenzgruppen aus verschiedenen Labors, so ist dies ein Anzeichen für methodische oder ethnische Unterschiede.

Auf diese Weise kann ein relationales System zur objektiven molekularen Beschreibung von Krankheiten oder von elementaren Zellzuständen wie Differenzierung, Reifung, Teilung oder Malignität auf Zellniveau erstellt werden. Verschiedene Zelltypen stehen in einer standardisierten Bezug zueinander in einer Art periodischem System der Zellen.


Humanzytomprojekt

Mit diesen Gedanken im Hintergrund können bei einem Humanzytomprojekt gegenwärtig drei Hauptebenen unterschieden werden.

Auf der ersten Ebene wird das Zellverhalten im Lebenszyklus angesprochen unter Einschluß von Zellzykluskontrolle, Biomolekülsynthese, Molekülimport und Export, Energie- und oxido-reduktive Bilanz sowie Organellenfunktion um nur einige wichtige Phänomene anzusprechnen. Es erscheint ebenfalls wichtig, die signifikante Dispersion vieler Zellpopulationsparameter im Bereich zwischen 1:10 bis zu 1:10.000 anzusprechen, wie sie durch die Variationskoeffizienten ihrer Werteverteilungen angezeigt wird. Die multiparametrische Heterogenität von Zellen in ihrer kombinatorischen Multiplizität kann von hoher Bedeutung für die zuverlässige Anpassung von Zellen an neue Umgebungsbedingungen und für die Empfänglichkeit oder Resistenz gegenüber Krankheiten oder Therapie sein.

Auf der zweiten Ebene werden Einzelzellpräparationen entweder wie gesammelt oder nach mechanischer bzw. enzymatischer Aufarbeitung mittels Durchfluß- oder Bildzytometrie untersucht, um den Molekularstatus normaler oder kranker Zellen als Deskriptoren für Gesundheit und Krankheit zu bestimmen. Diese Unterscheidung hängt nicht notwendigerweise von der originalen in-situ Anordnung det Zellen im Gewebe ab, wenn die Schlußfolgerungen aus dem Molekularstatus spezifischer Zellen oder Zellkombinationen gezogen werden.

Die dritte Ebene betrifft Zellen in assemblierten Geweben. Hierbei können die molekularen Zwischenbeziehungen und die Nähe der Zellen bei Gesundheit oder Krankheit innerhalb einer intakter Zellarchitektur und unter den komplexesten Bedingungen auf höchstem Organisationsniveau untersucht werden.


Meilensteine

Innerhalb des Rahmens eines Humanzytomprojektes können eine Vielzahl von Projekten für die Bereiche Medizin und Zellbiologie konzipiert werden. Die nachfolgende Liste führt einige Bereiche von potentiellem Interesse auf.

Medizin

- Leukämien/Lymphome: Chemotherapie gegenüber Stammzelltransplantation
- rheumatische Erkrankungen: frühzeitige Identifizierung von Patienten für Hoch- und Niedrigdosistherapie
- Infektionen: Vorhersage von Infektionen und deren Krankheitsverlauf bei Neugeborenene, in der Intensivmedizin sowie bei älteren Patienten zur frühen Anwendung präventivmedizinischer Therapien.
- Allergien: frühzeitige Entdeckung der Sensibilisierung vor dem apparenten Krankheitsbeginn z.B. bei Asthma, Ekzemen, Neurodermitis in Risikofamilien zur frühen Krankheitsprävention

Zellbiologie

- Stammzelldifferenzierung & Zellzyklus: standardisierte Beschreibung von Differenzierungsvorgängen und Zellzyklusphasen
- Zellproteomik: molekulare Topologie intrazellulärer Proteine
- Identifzierung pharmazeutischer Zielmoleküle: retrograde Exploration molekularer Krankheitswegen aus differentiell ermittelten molekularen Brennpunkten


Schlußfolgerungen

- Da Krankheiten durch Abweichungen von typischen molekularen Prozessen in Zellen oder Zellsystemen entstehen, ist ein detailliertes molekulares Wissen über die enorme Biokomplexität solcher Systeme unter den Bedingungen von Normalität und Krankheit erforderlich, um die Mechanismen von Krankheitsprozessen zu verstehen.

- Das notwendigte Wissen kann durch eine vielschichtige molekulare Einzelzellanalyse nahe an den in-vivo Bedingungen im Zusammenhang mit einer erschöpfenden bioinformatischen Wissensextraktion (Zytomik) gewonnen werden.

- Die Untersuchungsresultate werden in ein relationalen Wissenssystem oder Rahmenwerk eingebracht und stehen für die wissenschaftliche Hypothesenbildung, ebenso wie für direkt Medizin-bezogene Verwendungen, wie Prädiktivmedizin mittels Zytomik d.h. Vorhersagen über den Therapie-abhängigen zukünftigen Krankheitsverlauf beim Einzelpatienten sowie personalisierte Therapiemöglichkeiten und die Suche nach neuen pharmazeutischen Zielmolekülen zur Verfügung.

- Die Einrichtung eines derartigen relationalen Wissenssystems bei gleichzeitiger Weiterentwicklung Einzelzell-orientierter instrumenteller Untersuchungstechniken sowie empfindlicher Biomolekülmarkierungen in einem Humanzytomprojekt stellt eine für verschiedenste Bereich der Bioforschung vielversprechende Herausforderung an Wissenschaft, Medizin und Technologieinnovation dar.


Literaturhinweise

L5. Valet G, Murphy RF, Robinson JP, Tárnok A, Kriete A. Cytomics - from cell states to predictive medicine. In: Computational Systems Biology, Eds: Kriete A, Eils R, Elsevier, Amsterdam, 2006 p 363-381 (PDF)
L4. Valet G, Tárnok A. Potential and challenges of a human cytome project. JBRHA 18:87-91 (2004) (PDF)
L3. Valet G, Leary JF, Tárnok A. Cytomics - new technologies: towards a Human Cytome Project. Cytometry 59A:167-171 (2004) *external link (PDF)
L2. Valet G, Tárnok A. Cytomics in Predictive Medicine. Cytometry 53B:1-3 (2003) *external link (PDF)
L1. Valet G. Predictive Medicine by Cytomics: Potential and Challenges. JBRHA 16:164-167 (2002) (PDF)
- weitere diesbezügliche Literatur: human cytome project, predictive medicine & systems biology
- siehe auch: zusätzliche Referenzen


Konzeptentwicklung

Konferenzvorträge 2004/2005:
- extern Verbindung FOM2004, Philadelphia, USA
- externe Verbindung ISLH2004, Barcelona, Spain
- externe Verbindung 9th Workshop 2004, Leipzig, Germany
- externe Verbindung ISAC XXII, Montpellier, France
- externe Verbindung BSS'2004, Gdansk, Poland
- externe Verbindung EWGCCA2004, Mol, Belgium
- externe Verbindung Workshop Cell within Cytomics, Caceres, Spain
- externe Verbindung 10th Workshop 2005, Leipzig, Germany
- externe Verbindung 9th Congr.Soc.Ibérica de Citometria 2005, Porto, Portugal

externe Verbindung 2003 CD8 2004
ISBN: 1-890473-C6-5

- siehe: externe Verbindung Purdue CD-ROM Serie



© 2017 G.Valet
INTERNET: http://www.classimed.de http://www.classimed.de/cellbio.html
Letzte Aufdatierung: 11.01.2017
Erste Darstellung: 14.01.2004